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La genética forense, el DNA como DNI genético

Con la denominación de genética forense se define el uso de ciertas técnicas empleadas en genética para la identificación de los individuos en base al análisis de los polimorfismos del DNA. Básicamente se centra en tres áreas:

a. Identificación de personas desaparecidas a partir del cadáver
b. Investigación de la paternidad, tanto desde el punto de vista de la reclamación como de la impugnación
c. Criminología, análisis de restos orgánicos como pelos, semen, saliva, sangre, etc. Que han quedado en la escena de un crimen o de un delito sexual.

¿pero en qué consisten estas técnicas?

El DNA, probablemente las siglas que definirán el siglo XXI, es un Universo sin explorar, se conocen muchos aspectos sobre él, pero justo estamos empezando a conocer sus secretos. Sólo una pequeña parte de toda la molécula nos hace diferentes los unos a los otros, en la estructura y organización de la molécula de DNA no hay razas, ni diferencias intelectuales, ni religiosas, esos aspectos son consecuencia de nuestra cultura global, en el DNA, lo que hay de diferente, son ciertas secuencias que nos hacen únicos y por lo tanto, identificables con cierta fiabilidad a través de ellas. La genética forense analiza el DNA genómico, también llamado cromosómico, el mitocondrial y los polimorfismos del cromosoma Y. Toda la terminología abstracta quedará definida en próximos artículos.

Del DNA genómico se estudian las secuencias repetidas en tandem o VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) de las que hay dos tipos, MVR (minisatellite variant repeats) o secuencias minisatélite de hasta 60 pb y microsatélite o STR (short tandem repeats) que tienen una cadencia de hasta 6 pb, por ejemplo ATTC se repetiría 2 veces como ATTCATTC. También se estudian marcadores como HLA-Clase I y Clase ll, que tienen docenas de locis hipervariables que están estrechamente ligados y RPFLs.

El DNA mitocondrial tiene como característica que su herencia es siempre materna. Se analizan dos regiones hipervariables del llamado lazo Z.

Respecto de los polimorfismos del cromosoma Y se analizan microsatélites (STRs) y el polimorfismo de nucleótidos simples (SNPs).

El valor informativo de las secuencias de DNA que se emplean en la genética forense se basa en el grado de polimorfismo y en la frecuencia de los alelos en la población. Las ventajas del uso del DNA en la medicina legal son, entre otras, que bastan unos indicios mínimos ya que se utiliza PCR para amplificar la muestra, la calidad de la muestra no se ve especialmente comprometida ya que pueden emplearse los STR’s cuando se trata de tejidos en putrefacción o muestras milenarias y, finalmente, que el DNA está presente en la mayoría de los indicios que pueden recogerse de la escena de un crimen como el pelo, la piel, el semen, sangre, etc.

En el análisis e identificación se emplean estas técnicas:
- Southern-blotting e hibridación (con sondas): VNTR
- PCR
- Secuenciación de ADN mitocondrial

Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN
Nace a principios de siglo, cuando Karl Landsteiner describe el sistema ABO de los hematíes y Von Durgen y Hirschfeld descubren su transmisión hereditaria. Esta ciencia surgió como una rama de la Criminalística cuyo objetivo era la identificación genética tanto en casos de investigación criminal como en estudios biológicos de la paternidad. Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de antígenos eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), proteínas séricas, enzimas eritrocitarias y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores podía incluirse o excluirse una persona como posible sospechoso por poseer una combinación genética igual o diferente a la del vestigio biológico hallado en el lugar de los hechos.
Pero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su estructura y al posterior avance en las técnicas de análisis de dicha molécula la Hemogenética Forense evolucionó considerablemente hasta el punto de que hoy en día puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la Medicina Forense: la Genética Forense. Dicha ciencia estudia básicamente unas regiones del ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos, es decir, estudia regiones polimórficas del ADN. Así, analizando un determinado número de regiones polimórficas, la probabilidad de que dos individuos sean genéticamente iguales es prácticamente nula (excepto en el caso de gemelos univitelinos).
Aunque la Ciencia poseía las herramientas necesarias para el estudio del ADN, su aplicación en la resolución de casos judiciales no se produjo hasta 1985, cuando el Ministerio del Interior Británico solicitó la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor de Genética de la Universidad de Leicester. Los primeros casos de Criminalística fueron resueltos gracias a la técnica de los RFLPs (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica). Jeffreys descubrió la existencia de unas regiones minisatélites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser tratadas con enzimas de restricción generaban fragmentos de longitud variable. Estudios posteriores realizados el mismo Jeffreys demostraron que las diferencias en el tamaño de estos fragmentos se debían a que estas regiones consistían en un determinado número de repeticiones en tándem de una secuencia central, el cual variaba de unos individuos a otros.
El primer locus de ADN polimórfico fue descubierto por Wyman y White en 1980 usando una sonda de ADN arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de más de 15 longitudes diferentes en una pequeña muestra de individuos. Posteriormente se encontraron otros loci hipervariables como en la secuencia del gen de la insulina humana, en el oncogen “ras”, en el pseudogen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina. Estos loci hipervariables constaban de repeticiones en tándem de una secuencia de oligonucleótidos (11 a 60 pb), de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados dependían del número de dichas repeticiones y se les denominó VNTR (“Variable Number of Tandem Repeat”).
Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio que éstos podían ser aplicados a la medicina forense y sustituir a los marcadores clásicos.
En un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hizo por medio de la técnica llamada hibridación con sondas o Southern blot. Esta técnica consta básicamente de las siguientes etapas:
1. Digestión del ADN con enzimas de restricción tras conseguir extraer un ADN de alta molecularidad.
2. Separación de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa.
3. Desnaturalización de los fragmentos separados y cortados.
4. Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o nylon y fijación de las mismas por medio de calor (80ºC).
5. Prehibridación con sondas de ADN inespecífico para bloquear los lugares de unión inespecíficos que pudiera haber en la membrana.
6. Marcaje de la sonda con nucleótidos radioactivos (32 P normalmente).
7. Hibridación de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal.
8. Revelado en placa radiográfica e interpretación de los resultados.

El tipo de sondas utilizadas puede ser de dos tipos:
1. Sondas Mono-locus (SLP): son específicas para una región de un determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucleótidos y presentan mayor variabilidad que las sondas multi-locus. Como resultado se observan una o dos bandas por individuo, según sea homocigoto o heterocigoto. El patrón de bandas obtenido con estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN o “DNA profiling”

2. Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatélites presentes en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15 nucleótidos que se repiten múltiples veces y tras el revelado se observan de 10 a 20 bandas por persona. Este patrón de múltiples bandas se conoce como huella genética multilocus o “DNA fingerprint”.

• Sondas multi-locus y Sondas uni-locus
Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas e inconvenientes con respecto a una serie de parámetros como son:
Información aportada: las sondas multi-locus tienen una mayor capacidad discriminativa al aparecer múltiples bandas. No obstante, las mono-locus son más específicas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es de mayor tamaño.
Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas multi-locus se requiere aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y este ADN no necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el fragmento complementario a la+ sonda esté intacto.

Especificidad entre especies:
las sondas multi-locus permiten su uso sobre el ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que las mono-locus son exclusivas de ADN humano.

A pesar de que el análisis SLP ha sido y es bastante útil en estudios de paternidad no puede decirse lo mismo de su aplicación a la Criminalística ya que presenta una serie de inconvenientes como son:

*La cantidad de ADN que se necesita está entre 20 y 100 ng, cantidad difícil de conseguir en casos de criminalística en los que los indicios biológicos encontrados son mínimos.

*En cuanto a la calidad del ADN, en la práctica forense es muy difícil encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita para un análisis con sondas mono-locus.

*El tiempo requerido para este tipo de análisis es de dos o tres días.

*El hecho de que se requieran cantidades elevadas de ADN hacen que normalmente, con el primer análisis se consume la totalidad de la muestra, con lo que se dificultan contrapericias y una posterior revisión del caso.

Todas estas limitaciones fueron superadas gracias a la aplicación en Genética Forense de una técnica, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (“PCR”), que supuso una revolución en muchos campos de la Biología y de la Medicina.

El estudio de indicios biológicos por PCR ha permitido la resolución de un gran número de casos en Criminalística que hasta entonces eran desestimados por no poseer la suficiente cantidad de muestra para su análisis por RFLP. Con el uso de la PCR muestras tan mínimas como pueden ser un pelo con raíz, una minúscula mancha de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un análisis de identificación genética.

Análisis por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta técnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Química en 1993 por dicho invento.

Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés, "primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los primers y para la extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la reacción y se reduce la extensión de los primers unidos inespecíficamente al ADN.

La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos:

DESNATURALIZACIÓN: Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primers y una posterior extensión.

HIBRIDACIÓN: Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer.

Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no suele haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima e incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idónea, bien porque esté degradado o bien porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa. Si el ADN está degradado por la acción de enzimas de restricción el que obtengamos o no resultado en la amplificación va a depender de que el fragmento a amplificar haya sido dañado o no. En el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habría que intentar diluir al máximo la muestra para disminuir dichos contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN que no esté por debajo del límite de sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mínimas de ADN y la presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en Criminalística y requiere un estudio pormenorizado de la muestra antes de la amplificación.

Se utilizaron tambien Tecnicas de Identificacion Forense para registrar los datos obtenidos.

Futuras tecnologías: biochips

Las técnicas de análisis genético se encuentran hoy en día en continuo desarrollo y evolución.
Desde el análisis de los primeros polimorfismos de ADN con fines identificativos, la Genética Forense ha sufrido una gran evolución. Los expertos en la materia han sido testigos de cómo el descubrimiento de la PCR revolucionó las técnicas de identificación genética. Es probable que la próxima revolución la constituyan los llamados Biochips o microarrays.

La fabricación de los biochips es similar a la de los chips informáticos: por medio de la técnica denominada fotolitografía se depositan circuitos microscópicos sobre láminas de silicio. En el caso concreto de los biochips, estas láminas son de vidrio y lo que se deposita en dichas láminas son cadenas de ADN. Las láminas de vidrio presentan una serie de ventajas como son:

*Posibilidad de unir las cadenas de ADN a la superficie del cristal, convenientemente tratada, mediante enlaces covalente.
*Su capacidad para aguantar altas temperaturas y lavados de elevada fuerza iónica.

*Al ser un material no poroso el volumen de hibridación puede reducirse al mínimo.

CONCLUSIONES

El desarrollo científico ha permitido la introducción de la tecnología del ADN en la investigación forense, posibilitando el estudio de indicios biológicos mínimos, hecho que unos pocos años atrás era imposible. El Médico Forense se encuentra en una posición privilegiada para recoger algunos vestigios que por su fragilidad pueden alterarse o perderse como consecuencia de una actuación retrasada, permitiendo su estudio y la resolución del caso, con las consecuencias beneficiosas que de ello se derivarían.

Por otra parte, al margen de la profesionalidad y del compromiso deontológico, se está produciendo una exigencia por parte de la sociedad, cada vez más conocedora de la posibilidades técnicas existentes a través de los medios de comunicación, reclamando una responsabilidad profesional del personal encargado del caso, al igual que en otros campos de la Medicina. Así en Estados Unidos se han presentado ya querellas criminales contra hospitales, médicos y cuerpos policiales no federales por mal praxis y negligencia, al no recoger indicios criminales que podrían haber conducido a la identificación del autor de los hechos denunciados (en la mayoría de las reclamaciones admitidas, por defectos en la toma o conservación de supuestos indicios de semen en casos de violación).

El estudio del ADN ha supuesto un enorme "paso de gigante" en la identificación médico-forense, tanto en la investigación criminal, como en la investigación biológica de la paternidad. Las especiales circunstancias en las que se desenvuelve la primera de ellas hace que el potencial tecnológico no sea suficiente para la consecución del objetivo si previamente no se ha realizado un buen trabajo por parte del equipo de investigación encabezado por el Médico Forense, que por su formación y especialización es el profesional idóneo para valorar los indicios biológicos.

En los casos en los que haya que recoger las evidencias, debe hacerse en condiciones de máxima limpieza o esterilidad todos los indicios de origen biológico presentes, almacenándolos independientemente y adecuadamente identificados en cuántos recipientes estériles sea necesario y manteniéndolos custodiados en un frigorífico hasta recibir las instrucciones oportunas por parte de las Autoridades Judiciales. Cuando se proceda al envío de las muestras, hay que asegurarse de que no se romperá la "cadena de frío".